Wpływ warunków hodowli na rozdział i stopień czystości barwników cyklu diadinoksantynowego okrzemek P. tricornutum
W czasie przeprowadzonych badań hodowle okrzemek prowadzone były w zróżnicowanych warunkach, tj. w różnych temperaturach, przy różnych intensywnościach światła oraz w pożywkach, w obecności i bez obecności krzemu.
Początkowo przez dłuższy czas hodowle prowadzono w pomieszczeniu hodowlanym, w którym intensywność światła wynosiła 59 μmol∙m-2∙s-1, a temperatura była równa 23±1⁰C. W skład pożywki, w której wzrastały okrzemki nie wchodził Na2SiO3∙9H2O. Wybór takich warunków związany był z wcześniejszymi obserwacjami, które wskazywały, że sprzyjają one szybkiemu wzrostowi okrzemek.
Nagromadzoną znaczną ilość materiału z hodowli naświetlanych przed zwirowaniem i z hodowli przechowywanych w ciemności poddawano badaniom mającym na celu wyizolowanie obu barwników cyklu z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC) (Rys. 8.1) oraz sprawdzenie ich czystości.
Dla wyekstrahowanych acetonem barwników zmierzono widma w zakresie 340 – 550 nm (Rys. 8.2 i 8.3). Porównując je z widmami wzorcowymi (Rys. 4.5) można stwierdzić, że powyższe warunki hodowli pozwalają pozyskać czystą Dtx oraz zanieczyszczoną Ddx, co widoczne jest także na płytkach chromatograficznych z rozdzielonymi barwnikami.
Rys. 8.1. Płytki TLC z rozdzielonymi barwnikami okrzemek, pozyskanymi z hodowli prowadzonej w T=23±1⁰C, w pożywce bez dodatku Na2SiO3∙9H2O i przy intensywności światła 59 μmol∙ ∙m-2∙s-1
Rys. 8.2. Widmo absorpcyjne Ddx pozyskanej z hodowli okrzemek prowadzonej w T = 23±1⁰C, w pożywce bez dodatku Na2SiO3∙9H2O i przy intensywności światła 59 μmol∙m-2∙s-1
Rys. 8.3. Widmo absorpcyjne Dtx pozyskanej z hodowli okrzemek prowadzonej w T = 23±1⁰C, w pożywce pozbawionej Na2SiO3∙9H2O i przy intensywności światła 59 μmol∙m-2∙s-1
Ze względu na trudności z otrzymaniem czystej Ddx zdecydowano się na rozpoczęcie hodowli w warunkach różniących się temperaturą i intensywnością światła, tj. na hodowlę w T = 20⁰C, przy intensywności światła w przedziale 140 – 192 μmol∙ ∙m-2∙s-1oraz w T = 15⁰C, przy intensywności światła mieszczącej się w przedziale 157 – 219 μmol∙m-2∙s-1. Rozdział barwników z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (Rys. 8.4) ponownie pozwolił uzyskać czystą Dtx oraz zanieczyszczoną Ddx, choć stopień zanieczyszczenia był niższy niż w wyżej opisanej procedurze. Potwierdzają to otrzymane widma absorpcyjne (Rys. 8.5 i 8.6). Analiza barwników pozyskanych z hodowli prowadzonej w 20⁰C bez dodatku krzemu, zwirowanej po krótszej liczbie dni (6 – 7), pozwoliła uzyskać czystą Ddx.
Rys. 8.4. Płytki TLC z rozdzielonymi barwnikami z hodowli okrzemek prowadzonych w warunkach
a) T =15⁰C przy intensywności światła 157 – 219 μmol∙m-2∙s-1, b) T = 20⁰C przy intensywności światła 140 – 192 μmol∙m-2∙s-1
Rys. 8.5. Widmo absorpcyjne Ddx pozyskanej z hodowli prowadzonej w T = 20⁰C, przy intensywności światła 140 – 192 μmol∙m-2∙s-1
Rys. 8.6. Widmo absorpcyjne Ddx pozyskanej z hodowli prowadzonej w T = 15⁰C, przy intensywności światła 157 – 219 μmol∙m-2∙s-1
Przedstawione powyżej widma pozwalają zauważyć przesunięcie szczytu pasma przy około 416 nm w kierunku dłuższych długości fali wraz ze spadkiem temperatury prowadzenia hodowli (Rys. 8.7). Nadal widoczna jest jednak różnica względem widma wzorcowego, co świadczy o obecności zanieczyszczenia.
Rys. 8.7. Widma absorpcyjne Ddx pozyskanej z hodowli prowadzonej w pożywce pozbawionej metakrzemianu sodu, w różnych temperaturach i intensywnościach światła
W związku z występowaniem zanieczyszczenia jeszcze bardziej zmodyfikowano warunki hodowli. Oprócz temperatury i intensywności światła zmieniono również skład pożywki, dodając do niej Na2SiO3∙9H2O. Dodatkowo do 5 dni skrócono czas, po jakim pobierano komórki z hodowli. Rozpoczęto prowadzenie hodowli w 12⁰C bez dodatku i z dodatkiem Na2SiO3∙9H2O oraz w 15⁰C, w obecności Na2SiO3∙9H2O. Po przeprowadzeniu rozdziału metodą wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (Rys. 8.8.) i ekstrakcji barwników z płytki, zmierzono dla nich widma absorpcyjne (Rys. 8.9, 8.10, 8.11).
Rys. 8.8. Rozdział barwników okrzemek z hodowli prowadzonych a) w T = 12⁰C, z dodatkiem Na2SiO3∙9H2O, przy intensywności światła 91 – 181 μmol∙m-2∙s-1, b) w T = 15⁰C, z dodatkiem Na2SiO3∙9H2O, przy intensywności światła 157 – 219 μmol∙m-2∙s-1, c) w T = 12⁰C, bez dodatku Na2SiO3∙9H2O, przy intensywności światła 91 – 181 μmol∙m-2∙s-1
Rys. 8.9. Widmo absorpcyjne Ddx pozyskanej z hodowli prowadzonej w T = 12⁰C, z dodatkiem Na2SiO3∙9H2O, przy intensywności światła 91 – 181 μmol∙m-2∙s-1
Rys. 8.10. Widmo absorpcyjne Ddx pozyskanej z hodowli okrzemek prowadzonej w T = 12⁰C, bez dodatku Na2SiO3∙9H2O, przy intensywności światła 91 – 181 μmol∙m-2∙s-1
Rys. 8.11. Widmo absorpcyjne Ddx pozyskanej z hodowli okrzemek prowadzonej w T = 15⁰C, z dodatkiem Na2SiO3∙9H2O, przy intensywności światła 157 – 219 μmol∙m-2∙s-1
Już analiza płytek z rozdzielonymi barwnikami pozwoliła stwierdzić, że otrzymana Ddx pozbawiona była zanieczyszczenia. Potwierdzają to widma absorpcyjne barwnika pozyskanego z poszczególnych warunków. Widma te są zgodne z widmem wzorcowym Ddx.
Dodatkowym kryterium pozwalającym określić czystość barwników jest stosunek pasma III do II widocznego na widmie, pomnożony przez 100 (Tab. 8.1., 8.2.).
Tabela 8.1. Zestawienie stosunków pasm III/II (%) odczytanych z widm absorpcyjnych Ddx otrzymanej w różnych warunkach, w porównaniu z danymi wzorcowymi
-
Barwnik - warunki Stosunek pasm III/II (%) Ddx (aceton) – wzorzec (Johansen et al. 1974); (Bjørnland 1990b) 61; 63 Ddx (aceton) (23±1⁰C; 59 μmol∙m-2∙s-1;-Si) (2 pomiary) 14,2 (±1,43) Ddx (aceton) (20⁰C; 140 – 192 μmol∙m-2∙s-1;-Si) 33,3 Ddx (aceton) (15⁰C; 157 – 219 μmol∙m-2∙s-1;-Si) (2 pomiary) 31,9 (±0,61) Ddx (aceton) (12⁰C; 91 – 181 μmol∙m-2∙s-1;-Si) (2 pomiary) 60,7 (±1,22) Ddx (aceton) (15⁰C; 157 – 219 μmol∙m-2∙s-1;+Si) (2 pomiary) 50,5 (±2,38) Ddx (aceton) (12⁰C; 91 – 181 μmol∙m-2∙s-1;+Si) (2 pomiary) 58,1 (±2,65)
Tabela 8.2. Zestawienie stosunków pasm III/II (%) odczytanych z widm absorpcyjnych Dtx otrzymanej z hodowli okrzemek pozyskanych w T = 23±1⁰C, przy intensywności światła 59 μmol∙ ∙m-2∙s-1i pożywce pozbawionej Na2SiO3∙9H2O, w porównaniu z danymi wzorcowymi
-
Barwnik - warunki Stosunek pasm III/II (%) Dtx (aceton) – wzorzec (SCOR WG 78 data) (Bjørnland 1982) 42; 35 Dtx (aceton) – wyizolowana (wartość średnia z trzech pomiarów) 37,7 (±1,98)
Otrzymane wyniki wskazują, że optymalne warunki hodowli okrzemek P. tricornutum pozwalające wyizolować czystą Ddx to: T = 12⁰C, intensywność światła w zakresie 91 – 219 μmol∙m-2∙s-1, czas prowadzenia hodowli: 5 dni, nie zależnie od obecności w pożywce Na2SiO3∙9H2O. Dla hodowli prowadzonej z dodatkiem Na2SiO3∙9H2O czystą Ddx można otrzymać także w temperaturze 15⁰C, przy intensywności światła 157 – 219 μmol∙m-2∙s-1.
Natomiast czystą Dtx można pozyskać z hodowli prowadzonej w każdych z wymienionych powyżej warunków.
W celu sprawdzenia stabilności wyizolowanych barwników zbadano ich widma absorpcyjne po upływie pewnego czasu od zamrożenia. Badania wstępne przeprowadzono na Ddx pozyskanej z hodowli prowadzonej w T = 12⁰C, w pożywce z Na2SiO3∙9H2O oraz przy intensywności światła 91 – 181 μmol∙m-2∙s-1. Widmo barwnika zmierzono w dniu izolacji oraz dwa tygodnie później. Po nałożeniu obu widm okazało się, że barwnik nie uległ degradacji (Rys. 8.12).
Rys. 8.12. Nałożone widma absorpcyjne Ddx pozyskanej z hodowli prowadzonej w T = 12 ⁰C, w pożywce z Na2SiO3∙9H2O oraz przy intensywności światła 91 – 181 μmol∙m-2∙s-1, zmierzonego w dniu izolacji i dwa tygodnie później
Podobne badania przeprowadzono dla Dtx. Otrzymane wyniki wskazują na stabilność obu barwników w warunkach przechowywania (T = -20⁰C).
Aby określić wydajność rozdziału barwników określono zawartość Chla w badanej próbce (rozdz. 7.3.2.). Dokonano tego dla Ddx pozyskanej z hodowli prowadzonych w dwóch temperaturach: 12⁰C (±Na2SiO3∙9H2O), 15⁰C (+Na2SiO3∙9H2O). Z wszystkich warunków zgromadzono po dwa osady, wcześniej mierząc gęstość optyczną (OD) hodowli, z której je uzyskano.
Dla każdej próbki z określono stężenie Ddx z prawa Lamberta-Beera (A=ε∙l∙c). Wyniki zamieszczono w tabeli 8.3.
Tabela 8.3. Zawartość Ddx w aparacie fotosyntetycznym okrzemek P. tricornutum, hodowanych w różnych warunkach oraz zawartość Dtx z hodowli prowadzonej w T = 15⁰C z dodatkiem Na2SiO3∙9H2O (hodowle przed zwirowaniem przechowywane w ciemności)
-
Ddx (12⁰C + Si) Ddx (12⁰C – Si) Ddx (15⁰C + Si) Dtx (15⁰C + Si) OD I I II I II I 0,069 0,052 0,062 0,062 Zawartość Chla [μg/ml] 568,65 410,19 447,27 839,46 884,85 839,46 Stężenie [µM] 40,81 70,29 36,52 50,71 33,11 9,35
Zanieczyszczoną Ddx pozyskaną z hodowli prowadzonej w T = 23±1⁰C, przy intensywności światła 59 μmol∙m-2∙s-1i bez dodatku metakrzemianu sodu, poddano oczyszczaniu. Badania wstępne pozwoliły ustalić skład mieszaniny ekstrakcyjnej oraz rodzaj płytki TLC, umożliwiających rozdział zanieczyszczenia od Ddx. Mieszaniną tą okazał się 60% aceton na płytce TLC (żel krzemionkowy 60 F 254) (Rys. 8.15).
Rys. 8.13. Płytki TLC, na których przeprowadzono próbę oczyszczenia zanieczyszczonej Ddx
W celu pozyskania oczyszczonej Ddx przeprowadzono rozdział na płytce preparatywnej TLC (żel krzemionkowy 60), jednak zakończyło się to niepowodzeniem. Planowane są dalsze badania, mające na celu otrzymanie Ddx na płytce preparatywnej TLC (żel krzemionkowy 60 F254).
W trakcie przeprowadzonej izolacji, z hodowli prowadzonych w warunkach pozwalających na pozyskanie czystej Ddx i Dtx (T = 12⁰C, ± Na2SiO3∙9H2O i T = 15⁰C + Na2SiO3∙9H2O), zebrano również Fx w celu sprawdzenia jej czystości. Otrzymano czysty barwnik, co potwierdza zgodność widma absorpcyjnego z widmem wzorcowym (Rys. 8.14.) oraz zbliżony do właściwego stosunek pasma III do II (Tab. 8.4.).
Rys. 8.14. Widmo absorpcyjne Fx wyizolowanej z hodowli prowadzonych w różnych warunkach
Tabela 8.4. Zestawienie stosunków pasm III/II (%) odczytanych z widm absorpcyjnych Fx otrzymanej z hodowli okrzemek pozyskanych w różnych warunkachw porównaniu z danymi wzorcowymi
| Barwnik - warunki | III/II ∙100 |
| Fx – aceton (SCOR WG 78 data; Berger et al. 1977; Haugan & Jeffrey 1987; Wright & Jeffrey 1987) | 4; 3 |
| Fx – aceton (12 stopni – Si) (2 pomiary) | 6,11 (±0,78) |
| Fx – aceton (12 stopni + Si) (2 pomiary) | 13,4 (±1,27) |
| Fx – aceton (15 stopni + Si) (2pomiary) | 14,5 (±2,12) |
Podobnie jak dla Ddx i Dtx określono stężenie Fx w materiale pozyskanym z hodowli prowadzonych w temperaturze: 12⁰C (±Na2SiO3∙9H2O) i 15⁰C (+Na2SiO3∙9H2O) (Tab. 8.5.).
Tabela 8.5. Zawartość Fx w aparacie fotosyntetycznym okrzemek P. tricornutum, hodowanych w różnych warunkach
| Fx (12⁰C + Si) | Fx (12⁰C – Si) | Fx (15⁰C + Si) | |||
| OD | I | I | II | I | II |
| 0,069 | 0,052 | 0,062 | |||
| Zawartość Chla [μg/ml] | 568,65 | 410,19 | 447,27 | 839,46 | 884,85 |
| Stężenie [µM] | 77,02 | 119,37 | 120,09 | 116,13 | 83,67 |
Dyskusja i wnioski
Na podstawie danych eksperymentalnych ustalono, że zakres temperatur odpowiedni dla prowadzenia hodowli większości glonów to 17 – 22⁰C. Temperatura przekraczająca 27⁰C może powodować ich śmierć [34]. Analizując otrzymane wyniki można zaobserwować, że zanieczyszczenie Ddx występuje w przypadku hodowli prowadzonych w T = 23±1, 20, 15⁰C, przy intensywnościach światła w zakresie 59 – 219 μmol∙m-2∙s-1bez dodatku Na2SiO3∙9H2O, z których komórki pobierano po 7 – 10 dniach. Wraz ze wzrostem temperatury obserwowano wzrost stopnia zanieczyszczenia Ddx, co mogłoby świadczyć o zachodzeniu degradacji barwników pod wpływem podwyższonej temperatury hodowli. Jednak prowadząc hodowle w zmodyfikowanych warunkach (T = 12⁰C, ± Na2SiO3∙9H2O; T = 15⁰C + Na2SiO3∙9H2O; pobór komórek po 5 dniach) otrzymano czystą Ddx, co może wskazywać, że to nie temperatura a czas trwania hodowli ma wpływ na czystość barwnika. W celu potwierdzenia tej hipotezy należy przeprowadzić dalsze badania, w trakcie których czas prowadzenia hodowli w T = 23±1 i 20⁰C zostałby skrócony do 5 dni, natomiast w przypadku hodowli wzrastającej w T = 12⁰C wynosiłby 7 – 10 dni. Badań tych nie udało się przeprowadzić, ze względu na ograniczenia czasowe związane z koniecznością przygotowania niniejszej pracy.
Możliwe, że zanieczyszczenie Ddx w hodowlach trwających 7 – 10 dni wynika z rozkładu barwnika. Może to być związane z pewnymi negatywnymi procesami zachodzącymi po takim czasie w hodowli. Zbieranie komórek okrzemek powinno następować przy odpowiedniej gęstości optycznej hodowli [34]. Dla hodowli prowadzonych w T = 23±1, 20, 15⁰C, przy intensywnościach światła w zakresie 59 – 219 μmol∙m-2∙s-1bez dodatku Na2SiO3∙9H2O, z których materiał pobierano po 7 – 10 dniach nie mierzono gęstości optycznej, przez co nie można stwierdzić, czy była ona właściwa.
Zazwyczaj wzrost natężenia światła w pewnym zakresie przyczynia się do szybszego i lepszego wzrostu glonów [34]. Prawdopodobnie intensywność światła nie miała wpływu na degradację Ddx. Wiąże się to z częściowym pokryciem zakresu intensywności światła (91 – 219 μmol∙m-2∙s-1), przy zmianie warunków hodowli pod względem temperatury, z wcześniej stosowanym natężeniem promieniowania. Jednak można przypuszczać, że prowadzenie hodowli przez 7 – 10 dni przy danej intensywności światła mogło w pewnym stopniu niekorzystnie wpływać na stabilność Ddx.
Badania przemiany Ddx w Dtx u okrzemek słodkowodnych Nitzschia Parea dowiodły, że zachodzi ona przy intensywnym naświetlaniu hodowli [35]. Chcąc pozyskać Dtx, hodowle przed zwirowaniem poddawano działaniu światła o wysokim natężeniu. Z hodowli, z których pozyskiwano zanieczyszczoną Ddx otrzymywano czystą Dtx. Można przypuszczać, że Dtx powstawała z jeszcze niezdegradowanej Ddx. Mogłoby to świadczyć o tym, że rozkład Ddx mógł mieć miejsce na którymś z etapów izolacji. Na przykład w wyniku stosowania mieszaniny ekstrakcyjnej (chloroform:metanol:amoniak – 1:2:0,004 (v:v:v)), która w pewnym stopniu może przyczyniać się do izomeryzacji barwników. Jednak fakt, iż z późniejszych izolacji przeprowadzanych w ten sam sposób, otrzymywano czystą Ddx nie potwierdza tego przypuszczenia.
Wcześniej przeprowadzone badania dotyczące izolacji Fx, z wykorzystaniem solwentu (metanol:woda:amoniak – 9:1:0,12 (v:v:v)) dowodziły, że możliwe jest pozyskiwanie czystego barwnika [36]. Podobne wyniki uzyskano dla Fx z hodowli prowadzonych w różnych warunkach w trakcie realizacji badań do niniejszej pracy. Potwierdza to słuszność stosowania wspomnianego solwentu.
Należy więc uznać, że obserwowane zanieczyszczenie Ddx jest jakąś formą rozkładu pewnej puli tego barwnika. Rozkład ten związany jest z wiekiem hodowli, a powstałe produkty degradacji nie ulegają reakcji deepoksydacji i nie zanieczyszczają Dtx.
Ostatecznie udało się pozyskać czystą Dtx o stężeniu 12,1 μM oraz Ddx o stężeniu 57,8 μM.
komentarze
Copyright © 2008-2010 EPrace oraz autorzy prac.